Nato il 6 aprile 1957 a Milano, la sua città natale è Verano Brianza (Milano).

Nel 1977 entra nella Scuola Militare di Paracadutismo di Pisa, dove ottiene la qualifica di sottufficiale istruttore di paracadutismo. Nel 1980 fa il suo ingresso nelle Forze speciali italiane, ottenendo la qualifica di incursore paracadutista presso il 9º Reggimento Col Moschin. Viene inviato in Libano nella Forza Multinazionale di Pace, dal 1982 al 1984. Col grado di maggiore, è un ufficiale della riserva dell'Esercito Italiano.

Ottiene un Bachelor of Science in Aerospace Engineering nel 1988 dalla Polytechnic University of New York (USA) e, nel 1989 riceve, sempre dalla stessa università, un Master of Science in Aeronautics and Astronautics. L'Università degli Studi di Firenze gli riconosce, nel 1990, una Laurea in Ingegneria Meccanica.

Nel 1991 è entrato a far parte dell’ESA (European Space Agency) e nel 2007 ha volato come specialista con lo Space Shuttle Discovery, STS-120. Nel 2010 è tornato nella Stazione Spaziale Internazionale con la spedizione 26/27 come ingegnere di volo, rientrando nel 2011. Nel 2015 è stato scelto per la sua terza missione nello spazio e nella Stazione Spaziale Internazionale nel 2017.

In totale, nelle tre missioni del 2007, del 2010-2011 e del 2017 Paolo Nespoli è rimasto nello spazio per 313 giorni, 2 ore e 36 minuti.

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